GLIOBLASTOM - Anni Hofmann Stiftung

Zwischenbericht zu dem Projekt "Bedeutung des Hirntumormetabolismus für die Interaktion zwischen Tumorzellen und Hirngewebe" (Stand: Februar 2015)

Seit dem vorangegangenen Zwischenbericht im Mai 2014 wurden in den vergangenen neun Monaten die Arbeiten an den drei im Antrag formulierten Arbeitsteilprogrammen kontinuierlich fortgesetzt.

Im ersten Arbeitsteil wird untersucht, ob der Pentosephosphatweg (PPP) bzw. die Glykolyse auch unabhängig von Schwankungen der Sauerstoffkonzentration mit verstärkter Proliferation bzw. verstärkter Migration von Glioblastomzellen assoziiert sind. Nach umfangreichen methodischen Etablierungsarbeiten im ersten Jahr erfolgten nun Selektionen hochproliferativer Zellpopulationen aus verschiedenen Glioblastomzelllinien durch Markierung von Zellen mit PKH67, einem Fluoreszenzfarbstoff, der bei jeder Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben wird, wobei sich die Fluoreszenzintensität zunehmend abschwächt, so dass hierauf basierend hochproliferative Zellen angereichert werden können. Expressionsanalysen an mehreren Zelllinien zeigten, dass diese hochproliferativen Zellen eine signifikant verminderte Expression von Glykolyseenzymen verglichen mit niedrig proliferativen Zellen aufweisen, wobei parallel die Expression von Enzymen des PPP verstärkt ist. Die Selektion hochmigratorischer Zellsubpopulationen aus mehreren verschiedenen Zelllinien gelang durch Transwell-Assays, bei denen Glioblastomzellen durch Poren einer Membran hindurchmigrieren. Im Gegensatz zu hochproliferativen Zellen, zeigten hochmigratorische Populationen eine verstärkte Expression von Glykolyseenzymen bei verminderter Expression von PPP Enzymen. Darüberhinaus wiesen hochmigratorische Zellen eine verstärkte Expression von Tumorstammzellmarkern auf, wohingegen hochproliferative Zellen eine verminderte Expression zeigten, was dafür spricht, dass sich langsam teilende Zellen eine ausgeprägteren Stammzellphänotyp aufweisen.

Im zweiten Arbeitsteil wird untersucht, ob die Glykolyse bzw. der PPP direkt kausal relevant für die Zellmigration bzw. -proliferation sind. Hierzu wurden Analysen mit Enzyminhibitoren durchgeführt, die ergaben, dass eine Inhibierung der Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase [(G6PD), dem ersten und hauptregulatorischen Enzyme des PPP] mittels 6-Aminonicotinamid die Proliferation hemmt, bei gleichzeitiger Steigerung der Migration. Demgegenüber bewirkte eine Enzyminhibierung auf Ebene der Hexokinase (mittels 2-Deoxyglucose) eine Hemmung sowohl von Proliferation als auch Migration. Diese Ergebnisse wurden an mehreren verschiedenen Glioblastomzelllinien reproduziert. Des Weiteren wurde die Expression von G6PD und Aldolase C (das am stärksten hypoxieinduzierten Enzym der Glykolyse) mittels shRNA in zwei Glioblastomzelllinien herunterreguliert. In vitro Analysen zeigten, dass eine Herunterreuglation von G6PD konsistent eine verminderte Proliferation zur Folge hatte, wohingegen eine Herunterregulation von Aldolase C eine verminderte Migration bewirkte. In vivo Experimente mit einer hochproliferativen Zelllinie zeigten, dass eine Herunterregulation von G6PD ein verlängertes Überleben in einem Maus-Glioblastommodell zur Folge hatte, wohingegen eine Herunterregulation von Aldolase C zu verkürztem Überleben führte.

Im dritten Arbeitsteil wird untersucht, ob der sauerstoffkonzentrationsabhängige Switch zwischen PPP und Glykolyse ein generalisiertes Phänomen ist oder spezifisch für Glioblastomzellen ist, die unter Stammzellbedingungen kultiviert werden. Die Enzymexpressionsanalysen hierzu (unter Hypoxie versus Normoxie) erfolgten sowohl an normalen (untransformierten) Zelltypen die im Hirn vorkommen (Astrozyten, mesenchymalen Stammzellen, Endothelzellen, Fibroblasten, mononucleären Zellen) als auch an verschiedenen Tumorzelltypen (Glioblastom, Leber- und Brustkrebs). Dabei zeigte sich konsistent, dass die hypoxieinduzierte vermehrte Expression von Glykolyseenzymen bei gleichzeitig verminderter Expression von PPP Enzymen, sowohl auf Transkript- als auch auf Proteinebene, ein generelles Phänomen ist.

In den künftigen Arbeiten müssen die Selektionsanalysen (Teil 1) mit optimierten Selektionszeitpunkten teilweise wiederholt und erweitert werden, und es müssen Untersuchungen zur selektiven Stimulation von Proliferation bzw. Migration erfolgen. Des Weiteren werden Analysen zur Sensitivität selektierter Zellen gegenüber Enzyminhibitoren durchgeführt. Ferner stehen noch in vivo Experimente an weiteren Zellen und Experimente zur Inhibierung der Glucose-6-Phosphat-Isomerase (Teil 2) und Analysen verschiedener gewebsspezifischer Enzymisoformen sowie metabolische Fluxanalysen aus (Teil 3).