GLIOBLASTOM - Anni Hofmann Stiftung

Abschlussbericht über die 1. Förderperiode 2013 - 2015

Frau Prof. Dr. Herold-Mende (Heidelberg) mit dem Thema "Immunologische Veränderungen und Anpassung der Tumorumgebung im Zuge der Glioblastomprogression"

Ziel des von uns durchgeführten Forschungsprojektes war die Charakterisierung des immunrelevanten Mikromilieus im Zuge der Glioblastomprogression sowie die Identifizierung immunogener Zielstrukturen, die sich im Rahmen einer Immuntherapie künftig nutzen lassen könnten. Hierzu wurden u.a. die Tumorproben von extrem unterschiedlich überlebenden Glioblastompatienten genutzt sowie ein Kollektiv von 42 gepaarten Proben von primären und rezidivierenden Glioblastomen (pGBM, rGBM). Das ursprünglich angestrebte Kollektiv von 40 Paaren konnte somit erreicht werden. Als besonders dominante Immunzellpopulation im Glioblastom und als wichtige Einflussgröße von T Zell‐vermittelten Immunantworten wurden zunächst der Anteil und die Polarisierung der Mikroglia in Assoziation mit dem Überleben von Glioblastompatienten untersucht. Dafür wurden histologische Gewebedünnschnitte aller Tumorproben angefertigt, um diese mittels Mehrfachimmunfluoreszenzfärbungen und anschließender TissueFAXS-basierter Auswertung zu analysieren. Diese Analysen zeigten eine signifikante Anreicherung von immunsuppressiven M2-polarisierten Mikroglia in Glioblastompatienten mit einem Überleben von weniger als 10 Monaten im Vergleich zu länger überlebenden Patienten (> 3 Jahre, Geisenberger et al., Acta Neuropathol. 2015). Hinsichtlich des Vergleichs von Primärtumor und Rezidiv zeigte sich keine Veränderung von infiltrierten Mikrogliazellen im Allgemeinen. Die Analyse der Polarisierung ergab jedoch deutliche Unterschiede zwischen primären und rezidivierenden Glioblastomen. Die gleichzeitige Analyse einwandernder T‐Zellen ergab ebenfalls eine deutliche Veränderung im Rezidiv. Um die beobachteten Veränderungen hinsichtlich der Infiltration von Immunzellen besser zu verstehen, wurden Microarrayanalysen derselben Tumorproben durchgeführt. Dabei wurden massive Transkriptomveränderungen vom Primärtumor hin zum Rezidiv festgestellt, die auf Selektionsprozesse in Richtung eines ungünstigen immmunologischen Milieus hindeuten. Darüber hinaus wurden Luminexanalysen von 38 Glioblastomgeweben und korrespondierenden Tumorrezidiven  durchgeführt, um gezielte Informationen über Veränderungen von immunrelevanten Chemokinen und Cytokinen in Tumorlysaten von pGBM und rGBM zu erhalten. Diese Quantifizierung zeigte insbesondere im Rezidiv eine Abnahme von Faktoren, die eine Tumorabstoßung begünstigen und legt somit nahe, dass Immunantworten im Rezidiv stark beeinträchtigt werden. Die weitere Klärung dieser Frage wird Gegenstand der nächsten Förderperiode sein.

Um in unseren weiterführenden Analysen therapeutisch nutzbare, immunogene Strukturen und Veränderungen des immunogenen Repertoires vom Primärtumor hin zum Rezidiv zu identifizieren, wurde eine Kombination aus Proteomics‐basierter Proteinauftrennung (PF2D) und einem T‐Zell‐ Aktivierungsassay (IFN‐γ ELISpot Assay) genutzt (n = 5). Im Einklang mit den zuvor durchgeführten Transkriptomanalysen zeigten sich in allen untersuchten Patienten erhebliche Veränderungen in Form einer Abnahme wie auch einer Zunahme immunogener Tumorproteinfraktionen im Rezidiv bis hin zu einem völligen Shift des immunogenen Repertoires. Durch massenspektrometrische Analysen der Fraktionen, die eine signifikante Immunantwort gezeigt hatten, wurden bislang mehr als 1500 Proteine identifiziert. Nach einem intensiven Selektionsprozess wurden 19 Proteine, die sowohl in immunogenen Fraktionen von Primärtumoren wie auch in Rezidiven nachweisbar waren, hinsichtlich ihrer Eignung als Impfantigene zunächst durch eine Validierung im Ursprungspatienten, in gesunden Spendern sowie in weiteren Glioblastom‐Patienten getestet. Als besonders vielversprechend zeigten vier Proteine eine hohe Immunantwort in mehr als 30% der getesteten Glioblastom‐Patienten und keine oder nur geringe Immunantworten in gesunden Spendern. Als weiteren Hinweis hinsichtlich der Eignung als Impfantigene zur Behandlung des Glioblastoms konnte für drei dieser Proteine zusätzlich eine massive Überexpression und für zwei Proteine sogar eine inverse Überlebensabhängigkeit gezeigt werden.

Um abschließend einen umfassenderen Eindruck über die Immunantworten von Glioblastom‐Patienten zu erhalten und die Wirksamkeit von Immuntherapien gegen definierte Antigene testen zu können, wurde in unserer Gruppe ein diagnostisches Werkzeug entwickelt, mit dessen Hilfe sich Immunantworten im peripheren Blut überprüfen lassen (Mock et al., Oncotarget 2015). Sechs GBM-assoziierte Antigene wurden auf Glas‐Arrays gedruckt und eine bestehende Antikörper‐vermittelte Immunantwort im Serum getestet. Dabei konnte für das Peptid VCED des Antigens Tenascin C prognostische Antikörperantworten nachgewiesen werden und wird nun hinsichtlich seines Einsatzes als potenzieller Biomarker weiter validiert.