GLIOBLASTOM - Anni Hofmann Stiftung

Zwischenbericht zu dem Projekt "Tumormetabolismus - Interaktion zwischen Tumorzellen und Hirngewebe" (Stand: November 2016)

Das Forschungsprojekt verfolgt drei Hauptziele, deren Arbeitsfortschritte im Einzelnen dargestellt werden. Erstes Projektziel ist die Untersuchung der Kausalität der Assoziation von Glykolyse und Glioblastomzellmigration. Hypothese hierbei ist, dass das Glykolyseenzym Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI) bei der Migration und Invasion von Glioblastomzellen eine wichtige Rolle spielt. Denn GPI ist nicht nur ein Glykolyseenzym, sondern ist auch unter dem Namen Autocrine Motility Factor (AMF) bekannt als ein von Zellen sezernierter Faktor, der an den Zelloberflächenrezeptor AMFR binden und die Motilität z.B. von Melanomzellen steigern kann. Unsere bisherigen Arbeitsergebnisse zeigen, dass sowohl GPI/AMF als auch AMFR in Glioblastomen vorwiegend in hochgradig hypoxischen Regionen heraufreguliert sind. Ein Gewebsmicroarray zeigte darüberhinaus, dass eine hohe Expression von GPI/AMF mit einem kürzeren Überleben von Glioblastompatienten assoziiert ist. Untersuchungen an verschiedenen Glioblastomzelllinien ergaben, dass sowohl GPI/AMF also auch AMFR durch Hypoxie heraufreguliert werden und dass insbesondere die Sekretion von GPI/AMF in das Zellmedium durch Hypoxie erhöht wird. Funktionelle Experimente ergaben, dass GPI/AMF die chemotaktische Migration von Glioblastomzellen erheblich steigert, wohingegen die Proliferation insbesondere bei höheren Konzentrationen inhibiert wird. Der GPI/AMF-Inhibitor Erythrose-4-Phosphat inhibierte die Motilität der Zellen und durch Immundepletion von GPI/AMF aus dem Zellkulturüberstand ließ sich eine autokrine Stimulation der Zellmigration belegen. Eine Herunterregulation der Expression von GPI/AMF mittels shRNA führte zu verringerter Migration, wohingegen die Proliferation kaum verändert war. Derzeit stehen noch in vivo Versuche aus, bei denen die Zellen, in denen die Expression von GPI/AMF herunterreguliert wurde, als Xenografttumore implantiert werden, um deren Wachstum und Invasionsverhalten im Hirn von Mäusen zu beurteilen. Die bisherigen Untersuchungen zeigen also zusammenfassend, dass GPI/AMF ein außerordentlich potenter pro-migratorischer Faktor ist, wodurch die Assoziation zwischen Glykolyse und Zellmigration - zumindest teilweise - erklärt werden kann. Demzufolge ist GPI/AMF ein potenziell vielversprechendes Target für die Inhibierung der Invasion von Glioblastomzellen im Hirn.

Zweites Projektziel ist die Analyse der Relevanz intra- und intertumoraler Heterogenität für den Glioblastomzellmetabolismus. Intratumorale metabolische Heterogenität kommt in Glioblastomen unter anderem darin zum Ausdruck, dass in hochgradig hypoxischen Arealen Enzyme der Glycolyse hoch exprimiert sind, wohingegen Enzyme des Pentosephosphatwegs hier vergleichsweise gering exprimiert sind, wobei sich in hochproliferativen Arealen ein umgekehrtes Bild ergibt. Um die Ursachen und Mechanismen metabolischer Heterogenität auf klonaler Ebene Analysieren zu können, entwickelten wir ein klonales Farbmarkierungssystem (Optical Barcoding). Hiermit lässt sich das Schicksal individueller Zellen in heterogenen Kulturen in vitro sowie in Xenografttumoren in vivo verfolgen und es lassen sich aus den Tumoren individuelle Zellklone heraussortieren für differenzielle Analysen zur Adaptation an metabolischen Stress wie Hypoxie und Glucosemangel. Um intertumorale Unterschiede des Metabolismus bei Gliomen mit unterschiedlichem genetischen Entstehungshintergrund zu identifizieren, werden in Kooperation mit Prof. Glass transgene Mausgliomzellen untersucht, die Veränderungen der Gene TP53, PDGF-B, CDKN2a und EGFR aufweisen. Derzeit werden die Genexpressionsprofile dieser Zelllinien mittels RNAseq analysiert.

Drittes Projektziel ist die Charakterisierung der Hypoxie-Regulation weiterer Stoffwechselwege, die direkt oder indirekt mit der Glykolyse verknüpft sind. Hierzu erfolgten quantitative PCR Analysen und Western Blot Analysen von Enzymen des Serin-Synthesewegs, des Folsäure (C1)-Stoffwechsels, des Methioninzyklus sowie der Purin- und Pyrimidinbiosynthese. Hierbei zeigte sich, dass Enzyme des Folsäure-Zyklus überwiegend durch Hypoxie herunterreguliert werden, wohingegen Enzyme des Serinsynthesewegs heraufreguliert werden. Analysen an Tumormaterial ergaben, dass die Phosphoglycerate Dehydrogenase, das erste Enzym der Serinbiosynthese besonders hoch in IDH1-mutierten Gliomen exprimiert ist. Diese Analysen müssen ergänzt und an weiteren Zelllinien validiert werden, um ein komplexes Bild zu erhalten. Darüberhinaus stehen funktionelle Analysen zur Bedeutung ausgewählter Enzyme aus.